■ 产品简介
本产品利用高效重组酶和同源重组原理，只需DNA插入片段末端与载体末端具有15-20个同源碱基序列，就可以在载体的任意位点完成目的片段与载体的克隆重组。本产品可实现1-4个片段的高效无缝拼接；采用非连接酶克隆体系，可极大地降低载体的自连，保证产品克隆阳性率在90%以上。
■ 产品特点
1. 灵活的克隆位点：任何载体的任意位置。
2. 快速简便：30分钟完成载体构建。
3. 精确：不会增加任何额外的程序。
4. 效率高：高达90%阳性克隆率。
■ 无缝克隆流程图
■ 常见问答
1、“同源序列”指的是特殊序列吗？
答：无缝克隆要求的同源序列不是某个特殊序列，简单讲同源序列可以直接理解为“相同序列”，即DNA片段的连接处有15-20个相同的序列。
2、最佳克隆位点选择？
答：在选择克隆位点时，应避免选择上下游50bp内有重复序列的区域。当克隆位点上下游25bp区域内GC含量均在40%-60%范围内时，重组效率将达到最大。若高于70%或者低于30%，重组效率会受到较大影响。
3、同源序列的长度与退火温度计算？
答：同源序列长度推荐15-20bp。实验结果显示，低于15bp（如10bp），转化率明显下降；大于20bp（如30-40bp），转化效率差异不大，考虑成本，不推荐20bp以上。
计算扩增引物退火温度时，只需计算基因特异性扩增序列的Tm值，末端同源序列不应参与计算，为了得到高效率克隆，建议Tm≥48℃。
4、无缝克隆插入片段的最短长度？
答：建议插入片段≥100bp。
5、PCR扩增产物带A尾（或者其他尾）是否影响无缝克隆？
答：任何PCR酶扩增产物都可以用于无缝克隆，无需考虑产物末端有无A尾 (重组过程中将被去除，在最终载体中不会出现)。但为了减少扩增突变或者产物要求高保真时，建议使用高保真聚合酶进行扩增。
6、 酶切产物做无缝克隆是否要做去磷酸化处理？
答：不需要。
7、PCR产物做无缝克隆是否要切胶纯化？
答：PCR产物同时满足以下条件时，产物纯化即可，不必切胶纯化：
A、PCR模板不为质粒或者质粒抗性不同于目标载体；
B、无明显杂带且主带占95%以上。
8、无缝克隆长斑数较少？
答：主要可能有以下几种情况：
1）引物设计不合适：推荐【同源序列（15-25 bp）+完整的酶切位点+基因特异性扩增引物】，GC含量40% - 60%。
2）感受态细胞效率低：使用新鲜制备或妥善冻存的感受态细胞，确保其转化效率>107 cfu/μg。每次操作时可设置一组转化质粒的对照实验，以检测感受态细胞的转化效率。选择克隆感受态细胞(如DH5α)，不能选择表达感受态细胞。
3）线性化载体和插入片段扩增产物的使用量不足/过量，或者比例不佳：尽量按照推荐的量和比例配制重组反应体系。
4）线性化载体和插入片段扩增产物不纯，抑制反应：线性化载体和插入片段扩增产物未纯化，直接使用时，使用总体积应不超过反应体系体积的1/5，如10μL体系不超过2μL。建议线性化载体、插入片段扩增产物进行凝胶回收纯化，纯化产物溶解在ddH2O中。
9、出现较多假阳性？
答：主要有以下几种可能情况：
1）载体线性化不完全：即使是痕量未完全酶切的载体也会产生很高的转化背景。可通过阴性对照检测载体是否线性化完全，优化酶切体系，提高限制性内切酶使用量、延长酶切反应时间、胶回收纯化酶切产物等都可以有效减少环状质粒残留。
2）插入片段扩增产物混有非特异扩增产物。建议：①优化PCR体系，提高特异性；②胶回收PCR产物；③鉴定更多克隆。
3）反应体系中混入了相同抗性的质粒：PCR扩增模板(载体或插入片段)为环状质粒时，若扩增产物直接用于重组反应，残留环状质粒模板会产生较高的转化背景。建议扩增产物进行DpnI消化或扩增产物进行胶回收纯化。
10、菌落PCR无条带？
答：主要有以下可能情况：
1）引物不正确：推荐使用载体的通用引物或至少使用一条通用引物进行菌落PCR检测。
2）PCR体系或程序不合适：没有目的条带也没有空质粒条带。建议优化PCR体系、程序；或者提取质粒，以质粒做模板PCR验证；或者进行酶切验证。
3）重组失败：没有目的条带，只有空质粒的条带。说明重组不成功，载体线性化不完全，建议优化酶切体系。
