庄盟生物

当前位置:首页 - 技术服务 - 产品常见问题

蛋白实验常见问题

发布者:庄盟生物发布时间:2015-04-09浏览次数:1826次

1、蛋白样品不能反复冻融;

2、蛋白样品应加蛋白酶抑制剂,以增加蛋白的稳定性(建议最好能多加几中种蛋白酶抑制剂,具体细节请联系本公司技术人员);

3、细胞水平要做Western Blot,一般地5×106个细胞提取的蛋白够就足Western Blot;

4、如果目标蛋白是膜蛋白和胞浆蛋白,所用的去垢剂就要温和得多,建议提取后最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性;

5、若转膜不完全,可以加大上样量,还有转移时你可以用降低电流延长时间,转膜液中甲醇的比例多加5-10%;

6、如果上样量超载,可以浓缩样品,也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地,超载30%是不会有问题的。如果已经超了不少了,而且小分子量的也要,可以考虑加大胶的厚度,可以试试1.5mm的 comb;

7、蛋白变性后,-80℃,一两年没有问题。最关键两条:不要被蛋白酶水解掉;不要被细菌消化掉(也是被酶水解了);

8、脱脂奶粉中含生物素,如果实验中有涉及到“生物素”请将封闭液改为BSA封闭;

9、做200kd以上蛋白的Western Blot时要注意,分离胶最好选择>7%的;剥胶时要小心;转移时间需要相应延长;要做分子量参照(否则出现杂带不知道如何分析);

10、蛋白的上样量要根据实验的要求来定,如果要求是定量和半定量的Western Blot则上样量要均等,如果只是要定性,则没有太大的关系,尽量多上就行了,但是不要超过0.3μg/mm2;

11、一抗,二抗的比例是比较重要,调整好一抗,二抗的比例,可以去掉部分非特异的本底;12、免疫组化和Western Blot可以用同一种抗体吗?

解答:免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇(又称表位),有些表位是线性的,而有的属于构象型;线性表位不受蛋白变性的影响,天然蛋白和煮后的蛋白都含有;构象型表位由于受蛋白空间结构限制,煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸,也就是线性表位,那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western,而如果抗体识别构象形表位,则只能用于免疫组化。一般抗体说明书上都有注明此种抗体识别的氨基酸区间。(限于单抗);

13、抗体工作溶液一般不主张储存反复使用,但是如抗体比较珍贵,可反复使用2-3次。稀释后应在2-3天内使用,4度保存,避免反复冻融;

14、NC膜 PVDF膜 尼龙膜的差异。

尼龙膜是较理想的核酸固相支持物,有多种类型;硝酸纤维素膜是目前应用最广的一种固相支持物,价格最便宜;PVDF膜介于二者之间。

就结合能力而言:尼龙膜结合DNA和RNA能力可达480-600μg/cm2,可结合短至10bp的核酸片段;硝酸纤维素膜结合DNA和RNA能力可达80-100μg/cm2,对于200bp的核酸片段结合能力不强;PVDF膜结合DNA和RNA能力可达125-300μg/cm2。

就温度适应性而言:尼龙膜经烘烤或紫外线照射后,核酸中的部分嘧啶碱基可与膜上的正电荷结合;硝酸纤维素膜依靠疏水性相互作用结合DNA,结合不牢固;PVDF膜结合牢固,耐高温,特别适合于蛋白印迹。

就韧性而言:尼龙膜较强;硝酸纤维素膜较脆,易破碎;PVDF膜较强。

就重复性而言:尼龙膜可反复用于分子杂交,杂交后,探针分子可经碱变性被洗脱下来;硝酸纤维素膜不能重复使用;PVDF膜可以重复使用。

15、在做Western Blot时,PVDF膜用甲醇浸泡的目的。

PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团,使它更容易跟带负电的蛋白质结合,做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。

16、膜、滤纸、胶大小有何讲究?

解答:如果用的是半干法,顺序为:阴极-滤纸-胶-膜-滤纸。滤纸的长宽分别比胶面小1-2mm,而膜的长宽分别比胶大1-2mm。绝对禁忌:上下两层滤纸因为过大而相互接触,这样会短路,电流不会通过胶和滤纸。

17、电泳时Marker总跑不全所有条带,即使用增大胶浓度仍不全?

检查两种缓冲液Tris-HCl(pH 8.8和 pH 6.8),有可能有长菌现现象,建议重配两种缓冲液。

18、Western Blot染色的选择

(1)阴离子染料是最常用的,特别是氨基黑,脱色快,背景低检测极限可达到1.5μg,考马斯亮蓝虽然与氨基黑有相同的灵敏度,但脱色慢,背景高。丽春红S和快绿在检测后容易从蛋白质中除去 ,以便进行随后的氨基酸分析。缺点是:溶剂系统的甲醇会引起硝化纤维素膜的皱缩或破坏。不能用于正电荷的膜。灵敏度低。

(2)胶体金,灵敏度高,检测范围可到pg级,但染色不稳定。

(3)生物素化灵敏度位于1、2之间,可用于任何一种膜。

19、转膜液加甲醇的目的是什么?

加甲醇起着一定的固定作用,因为小分子蛋白质容易转出去.(特别是在硝酸纤维素膜上,因为NC膜结合蛋白质的能力较弱)。

20、转膜时何为湿法,何为半干法?

半干法和湿法转移是两种不同的转移装置下的转移系统,将膜,胶,滤纸整个浸泡在buffer的Tank里转移的,叫湿法;用滤纸吸buffer来做转移体系的叫半干法。

21、为什么浓缩胶和分离胶的电压不一致?同样的电压可以吗?

浓缩胶的目的使得loading 的样品能够在同一条水平线上进入分离胶 ,如果电压太大前端的蛋白容易在后面的蛋白赶上来前进入分离胶。而在分离的理论上(实际上也是)小电压长时间分离的效果会更好,但是在操作过程中没有必要等那么长的时间,所以就用大电压快点跑。