1、蛋白样品不能反复冻融；

2、蛋白样品应加蛋白酶抑制剂，以增加蛋白的稳定性（建议最好能多加几中种蛋白酶抑制剂,具体细节请联系本公司技术人员）；

3、细胞水平要做Western Blot，一般地5×10⁶个细胞提取的蛋白够就足Western Blot；

4、如果目标蛋白是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂就要温和得多，建议提取后最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性；

5、若转膜不完全，可以加大上样量，还有转移时你可以用降低电流延长时间，转膜液中甲醇的比例多加5－10％；

6、如果上样量超载，可以浓缩样品，也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超载30％是不会有问题的。如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试1.5mm的 comb；

7、蛋白变性后，－80℃，一两年没有问题。最关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉(也是被酶水解了)；

8、脱脂奶粉中含生物素，如果实验中有涉及到“生物素”请将封闭液改为BSA封闭；

9、做200kd以上蛋白的Western Blot时要注意，分离胶最好选择>7%的；剥胶时要小心；转移时间需要相应延长；要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析）；

10、蛋白的上样量要根据实验的要求来定，如果要求是定量和半定量的Western Blot则上样量要均等，如果只是要定性，则没有太大的关系，尽量多上就行了，但是不要超过0.3μg/mm2；

11、一抗，二抗的比例是比较重要，调整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特异的本底；12、免疫组化和Western Blot可以用同一种抗体吗？

解答：免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。一般抗体说明书上都有注明此种抗体识别的氨基酸区间。（限于单抗）；

13、抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用2－3次。稀释后应在2－3天内使用，4度保存，避免反复冻融；

14、NC膜 PVDF膜 尼龙膜的差异。

尼龙膜是较理想的核酸固相支持物，有多种类型；硝酸纤维素膜是目前应用最广的一种固相支持物，价格最便宜；PVDF膜介于二者之间。

就结合能力而言：尼龙膜结合DNA和RNA能力可达480－600μg/cm2，可结合短至10bp的核酸片段；硝酸纤维素膜结合DNA和RNA能力可达80－100μg/cm2，对于200bp的核酸片段结合能力不强；PVDF膜结合DNA和RNA能力可达125－300μg/cm2。

就温度适应性而言：尼龙膜经烘烤或紫外线照射后，核酸中的部分嘧啶碱基可与膜上的正电荷结合；硝酸纤维素膜依靠疏水性相互作用结合DNA，结合不牢固；PVDF膜结合牢固，耐高温，特别适合于蛋白印迹。

就韧性而言：尼龙膜较强；硝酸纤维素膜较脆，易破碎；PVDF膜较强。

就重复性而言：尼龙膜可反复用于分子杂交，杂交后，探针分子可经碱变性被洗脱下来；硝酸纤维素膜不能重复使用；PVDF膜可以重复使用。

15、在做Western Blot时，PVDF膜用甲醇浸泡的目的。

PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。

16、膜、滤纸、胶大小有何讲究？

解答：如果用的是半干法，顺序为：阴极－滤纸－胶－膜－滤纸。滤纸的长宽分别比胶面小1－2mm，而膜的长宽分别比胶大1－2mm。绝对禁忌：上下两层滤纸因为过大而相互接触，这样会短路，电流不会通过胶和滤纸。

17、电泳时Marker总跑不全所有条带，即使用增大胶浓度仍不全？

检查两种缓冲液Tris-HCl（pH 8.8和 pH 6.8），有可能有长菌现现象，建议重配两种缓冲液。

18、Western Blot染色的选择

（1）阴离子染料是最常用的，特别是氨基黑，脱色快，背景低检测极限可达到1.5μg，考马斯亮蓝虽然与氨基黑有相同的灵敏度，但脱色慢，背景高。丽春红S和快绿在检测后容易从蛋白质中除去 ，以便进行随后的氨基酸分析。缺点是：溶剂系统的甲醇会引起硝化纤维素膜的皱缩或破坏。不能用于正电荷的膜。灵敏度低。

（2）胶体金，灵敏度高，检测范围可到pg级，但染色不稳定。

（3）生物素化灵敏度位于1、2之间，可用于任何一种膜。

19、转膜液加甲醇的目的是什么？

加甲醇起着一定的固定作用，因为小分子蛋白质容易转出去.(特别是在硝酸纤维素膜上，因为NC膜结合蛋白质的能力较弱)。

20、转膜时何为湿法，何为半干法？

半干法和湿法转移是两种不同的转移装置下的转移系统，将膜，胶，滤纸整个浸泡在buffer的Tank里转移的，叫湿法；用滤纸吸buffer来做转移体系的叫半干法。

21、为什么浓缩胶和分离胶的电压不一致？同样的电压可以吗？

浓缩胶的目的使得loading 的样品能够在同一条水平线上进入分离胶 ，如果电压太大前端的蛋白容易在后面的蛋白赶上来前进入分离胶。而在分离的理论上（实际上也是）小电压长时间分离的效果会更好，但是在操作过程中没有必要等那么长的时间，所以就用大电压快点跑。