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克隆、转化相关问题

发布者:庄盟生物发布时间:2015-04-09浏览次数:2512次
保证亚克隆实验成功需做的照实验

为使亚克隆实验成功,并能在未获得目的克隆时,查明实验失败的原因,每次实验应包括相应的对照。其中包括:

感受态细胞的转化效率

抗菌素是否有效

连接的效率

未连接质粒的背景

磷酸酶处理的效果


检测感受态细胞的效果需作的照实验
为保证宿主细胞是感受态细胞,而且无污染,需作2个试验。
一、取1管分装的感受态细胞,不作转化(比如不加DNA,但和实验样品平行处理),将等量的细菌涂布到含抗菌素和不含抗菌素的平板上。含抗菌素的平板应无菌落生长,生长有菌落就表明污染了质粒或抗菌素失效,为区别可从生长的菌落中提取质粒,以鉴别原因。不含抗菌素的平板上应生长了许多菌落,甚至菌落群,反之表明细菌无活力。
二、确定感受态细胞的转化效率。将一定量的完整质粒转化到感受态细胞中,取一部分转化的细菌,涂布到选择培养基上,可用菌落生长单位/mgDNA,按下面的方法计算感受态细胞的转化效率:用0.1ng完整的质粒DNA转化100ml的感受态细胞,向转化反应液中加入900 ml培养液(0.1ng/1ml),让细菌恢复一小段时间(1小时)。将转化反应用培养液作1:10的稀释(0.01ng/ml),取其中100ml的稀释液来涂布(0.001ngDNA/100ml)。如能获得200个克隆,转化效率是2×108 cfu/mgDNA,计算方法如下: 200cfu/0.001ng=2×105 cfu/ng=2×108cfu/mgDNA

转化效率1×106 cfu/mgDNA可满足普通的亚克隆实验;1×107 cfu/mgDNA用于作更复杂的亚克隆,有限量的DNA的转化,T-克隆实验;构建文库和突变要求用的转化的效率为>1×108 cfu/mgDNA。


选择宿主菌株的因素
1、 所选的宿主菌株对所用质粒的抗生素抗型基因敏感;如进行蓝/白斑筛选,宿主菌β-半乳糖苷酶的α-肽编码区应在染色体或附加体上缺失掉( lac ZΔM15)。为Top10和DH5α能用于蓝/白斑筛选;。
2、 表达重组的蛋白和融合蛋白,应使用带T7 RNA聚合酶基因的菌株,如BL21(DE3)。特别是重组的蛋白对大肠杆菌有毒时;
3、 进行突变实验时,应选错配修复缺陷型菌株使突变的子链能复制( mut S菌株);

4、 使用pGEM载体克隆大片段时(>7-8Kb),转化时菌株在30℃而不是37℃生长,更有利于细胞的复苏。


检测连接反应的效果需做的对照实验

为检测连接反应的效果,线化(单限制性酶切,非磷酸酶处理)质粒需同实验样品平行连接。取一部分连接反应液用于转化,随后涂布到选择培养基上。平板上所生长的菌落数,可同相同量、未连接的线化质粒、转化相同数目的细菌后,涂布在选择培养基上所生长的菌落数比较。如果连接成功,自连接质粒在平板上的菌落数,会远远高于未连接的线化质粒转化细菌所得的菌落数。如果线化成功,未连接的线化质粒(未连接的质粒背景)所得的菌落数应很低。如连接效率高,则自连质粒所得的菌落数应同用完整质粒转化细菌所得的菌落数相近。 另一种非定量的方法是将等量的未连接质粒和连接质粒在琼脂上电泳,连接后的样品的迁移率会降低。


怎样提高连接转化效率?

1.确认Insert DNA片段的3'末端是否带有“A”尾。大部分的高保真DNA聚合酶(如:Pyrobest、PrimeSTAR HS、KOD、Pfx、Pfu等)扩增的PCR产物是平滑末端,不能直接进行TA克隆。

2.纯化PCR产物。最好使用切胶回收的PCR片段,以除去PCR产物中的非特异性片段和引物等杂质。进行切胶回收时可以使用庄盟是生物的小量琼脂糖凝胶回收试剂盒(ZP202)。

3.请使用转化效率大于108cfu/μg pUC19 DNA的感受态细胞。

4.DNA片段的立体结构、DNA片段的长短都会影响克隆效率。一般情况下,大片段DNA的克隆效率(连接效率与转化效率)偏低,此时可以延长连接反应时间,或采用电转化方法。

5.进行切胶回收纯化DNA片段时,不要使DNA片段在紫外线下暴露时间过长。

6.建议使用新配制的平板培养基。


阳性克隆鉴定方法有哪些?

1.蓝白斑筛选。

蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法,一般情况下,β-半乳糖苷酶的表达将受到破坏,重组克隆体在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养时将显示白色菌落。但有时比较短的DNA片段插入载体时,基因的读码框有可能正好与LacZ的读码框相吻合,克隆体也会显示蓝色菌落。有报道称,2 kbp的DNA片段插入到载体中后,重组克隆体仍显示了蓝色。所以,当我们没有得到白色菌落时,可以试着检测蓝色菌落。

2.菌落PCR方法。

以变性后的菌液为模板,使用载体通用引物进行PCR扩增鉴定。

使用灭菌后的牙签挑取白色菌落,在预备好的ddH2O(10μl)中蘸洗,99℃,10 min变性,冰上急冷,加入配制好的PCR混合液(引物,dNTP,Buffer, Taq等)。

94℃   1 min

94℃   30 sec

55℃   30 sec        30 Cycles

72℃   1 kbp/min

说明: a.所用引物通常为载体通用引物。

b.扩增产物的大小为载体通用引物之间大小+插入片段大小。
3.质粒PCR方法。

以提纯后的质粒DNA为模板,使用PCR扩增引物进行PCR扩增鉴定。

94℃   1 min

94℃   30 sec

55℃   30 sec       30 Cycles

72℃   1 kbp/min

说明:扩增产物的大小就是PCR产物的大小。

4.酶切方法。

利用载体多克隆位点上限制酶或者PCR引物导入酶切位点的限制酶,对提纯后的质粒DNA进 行双酶切鉴定。 说明:双酶切后,电泳显示两条带,分别为载体大小和PCR产物的大小。


蓝白斑筛选原理及问题总结

1 问题:做转化时,用蓝白斑筛选,以获得阳性克隆。那它和直接利用AMP抗性,而不用蓝白斑筛选,有什么区别吗?蓝白斑筛选有什么作用吗?

对于这一问题,我想,抗性筛选是防止杂菌生长。理论上说,当培养基中含有抗生素时,只有携带相应抗药性基因载体的细胞才能生存繁殖。蓝白筛选是验证是否有插入片断。两者结合起来,更有利于筛选到我们的目的菌。


2 问题:如果加了AMP、IPTG和X-Gal,长出来的白斑一定都是含有插入片段的吗?有没有可能是载体自连的?

答:可以说,世界上没有绝对的事情,即使加了AMP、IPTG和X-Gal,长出来的白斑也不一定都是含有插入片段的阳性克隆,具体原因可能有:
1)有可能是载体自连的假阳性;
2)作时AMP、IPTG和X-Gal其中一种或几种没涂均匀。
3)有时即使插入片段也会出现篮斑。只要编码框没被破坏。


3 问题:如何筛选重组菌落?

答:可使用蓝/白斑筛选法,在涂布有IPTG和X-Gal的筛选平板上,重组菌株为白色,未转入重组质粒的菌株为蓝色。


4 问题:蓝白斑筛选如何筛选合适的宿主菌株?

答:如进行蓝/白斑筛选,宿主菌β-半乳糖苷酶的α-肽编码区应在染色体或附加体上缺失掉(lacZΔΜ15)。TOP10和DH5α都能用于蓝/白斑筛选。


5 问题:在蓝白斑筛选的过程中没有蓝斑是什么原因导致的?因为通过PCR检测插入片段的大小表明所挑的白斑克隆并没有插入片段。

答:原因很多,

1)可能是你用的培养基含有乳糖或葡萄糖,因为半乳糖甘酶会分解乳糖,导致不能与X-Gal反应,葡萄糖不会诱导融合基因的表达。

2)作时AMPIPTGX-Gal其中一种或几种没涂均匀。

3)很多因素会造成PCR失败。


6 问题:我最近转化大肠杆菌时,通过蓝白斑筛选,挑出白色菌落做PCR,可是在电泳时发现在有目的带的同时还有比目的带小的杂带,不知为什么?我反复筛了几次,都是这样,可不可以摇菌提质粒?我应该下一步怎么做?

答:针对这样的情况,我觉得,你首先做酶切鉴定,看看你的目的片段是否真正插入。其次,你应该检测PCR过程有没有问题。


7 问题:我用Amp-IPTG-X-gal LB平板进行蓝白斑筛选重组子,为何筛出的全是白斑,没一个蓝斑,挑几个白斑摇菌扩增后PCR检测也全是阳性克隆,不会全都重组成功了吧?什么原因呢?

答:这样的情况是完全有可能的,只要载体处理的好,应该说是有这种可能。


蓝白斑筛选原理:
   
蓝白斑筛选是根据载体的遗传特征筛选重组子,如α-互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段,其中有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点(MCS),它并不破坏读框,但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能,这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此,宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性,但它们同时存在时,可形成具有酶学活性的蛋白质。这样,lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补,称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下,在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落,因而易于识别。然而,当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后,几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段,使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选,又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37温箱倒置培养12-16hr后,有重组质粒的细菌形成白色菌落。
IPTG
X-Gal介绍
    IPTGIsopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,也称Isopropyl β-D-thiogalactoside,中文名为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。分子式为C9H18O5S ,分子量为238.30CAS Number 367-93-1Ultra Puredioxane free,常用于蓝白斑筛选,如果在平板培养基中加入X–GalIPTG,由于β–半乳糖苷酶的α–互补性,可以根据是否呈现白色菌落(或噬菌斑)而方便地挑选出基因重组体。此外,它还可以作为具有lactac等启动子的表达载体的表达诱导物使用。
   X-Gal:中文名为5--4--3-吲哚-β-D-半乳糖苷。X-Galβ-半乳糖苷酶(β-galactosidase)的显色底物,β-半乳糖苷酶的催化下会产生蓝色产物。常用于β-半乳糖苷酶的原位染色检测以及蓝白斑筛选。
IPTG
X-Gal配置
IPTG配制成24 mg/ml100 mM)的水溶液,并进行过滤除菌后保存。
X-gal
用二基甲酰胺DMF溶解X-gal配制成的20mg/ml的贮存液。保存于一玻璃管或聚丙烯管中,装有X-gal溶液的试管须用铝箔封裹以防因受光照而被破坏,并应贮存于-20X-gal溶液无须过滤除菌。
使用方法:
  100 ml的琼脂培养基中,当培养基温度为55左右时,加入100 μl24 mg/ml100 mMIPTG200 μlX-Gal20 mg/ml)和100 μlAmp100 mg/ml),制作成IPTGX-GalAmp平板培养基。