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质粒提取的原理与常见问题

发布者:庄盟生物发布时间:2015-03-09浏览次数:1833次
质粒提取原理及常见问题解析
目前,已发现有质粒的细菌有几百种,已知的绝大多数的细菌质粒都是共价闭合环状DNA分子(简称cccDNA)。细菌质粒的相对分子质量一般较小,约为细菌染色体的0.5%~3%。根据相对分子质量的大小,大致上可以把质粒分成大小两类:较大一类的相对分子质量是40×106以上,较小一类的相对分子质量是10×106以下(少数质粒的相对分子质量介于两者之间)。每个细胞中的质粒数主要决定于质粒本身的复制特性。按照复制性质,可以把质粒分为两类:一类是严紧型质粒,当细胞染色体复制一次时,质粒也复制一次,每个细胞内只有1~2个质粒;另一类是松弛型质粒,当染色体复制停止后仍然能继续复制,每一个细胞内一般有20个左右质粒。这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的,每个细胞中含有10-200份拷贝,如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成还会使质粒拷贝数增至几千份。


质粒提取原理

现在较常用的质粒提取方法有三种:碱裂解法、煮沸法和去污剂裂解法,前两种方法较为剧烈,适用于较小的质粒(<15Kb),而去污剂裂解法则比较温合,一般用于分子量较大的质粒(>15Kb)。

碱裂解法是一种最广泛使用的制备质粒DNA的方法。其原理为:染色体DNA远远大于质粒DNA,染色体DNA为线状分子,而质粒为共价闭合环状分子。当pH 12.0-12.6碱性环境中,线性的大分子的染色体DNA完全变性,而共价闭环质粒DNA在将PH调至中性后即可以恢复其天然构象,在高盐浓度存在的条件下,染色体DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀,而质粒DNA仍为可溶状态,通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质,质粒DNA仍在上清中。


质粒提取常见问题分析

1、影响质粒提取的因素有哪些?
质粒提取的得率和质量与很多因素有关,如宿主菌的种类和培养条件、细菌细胞的裂解、质粒拷贝数、质粒的稳定性、抗生素、吸附膜的吸附能力、提取操作的熟练程度等等。
2、为什么从革兰氏阳性菌中提取质粒要在悬浮液中加入溶菌酶?
革兰氏阳性菌有一层细胞壁,必须加入溶菌酶才能使之溶解。
3、如何根据实验需要选择不同级别的产品?
从纯度上:各种常规操作,包括酶切、PCR、测序、文库筛选、连接和转化,普通纯度的质粒可以满足要求;而对于转染实验,则要求使用高纯度质粒提取试剂盒方能满足要求。
从提取的量上:1-20μg,应选择小量提取试剂盒;20-40μg,应选择中量提取试剂盒;大于40μg,应选择大量提取试剂盒。
从宿主菌上:分为普通细菌质粒提取试剂盒、G+菌质粒提取试剂盒和酵母菌质粒提取试剂盒,根据情况进行选择。
未提出质粒或质粒得率较低:
△ 大肠杆菌老化  
    请涂布平板培养后,重新挑选新菌落进行液体培养。
△ 质粒拷贝数低  
由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低,可更换具有相同功能的高拷贝数载体。
△ 菌体中无质粒  
    有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在,经多次转接后有可能造成质粒丢失。
    例如,柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定,因此不要频繁转接,每次接种时应接种单菌落。另外,检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。
△ 碱裂解不充分  
    使用过多菌体培养液,会导致菌体裂解不充分,可减少菌体用量或增加溶液1、2和3的用量。对低拷贝数质粒,提取时,可加倍使用溶液1、2和3,可能有助于增加质粒提取量和质粒质量。
△ 溶液使用不当
    溶液2、3在温度较低时可能出现浑浊,应置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液,才能使用。
△ 吸附柱过载
   不同产品中吸附柱吸附能力不同,如果需要提取的质粒量很大,请分多次提取。若用富集培养基,例如TB 或2×YT,菌液体积必须减少;若质粒或宿主菌是非常高的拷贝数或生长率,则需调整LB培养液体积。
△ 质粒未全部溶解(尤其质粒较大时)
    洗脱溶解质粒时,可适当加温或延长溶解时间。
△ 乙醇残留
    漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体,树脂型试剂盒漂洗后应晾干树脂,再加入洗脱缓冲液。
△ 洗脱液加入位置不正确
   洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。
△ 洗脱液不合适
    DNA只在适当pH值的低盐溶液中才能被洗脱,如洗脱缓冲液TE (10 mM Tris·Cl, pH 8.5)或水;洗脱效率取决于pH值。最大洗脱效率在pH 7.08.5间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内,如果pH过低可能导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至60℃后使更用有利于提高洗脱效率。
△ 洗脱体积太小
    洗脱体积对回收率有一定影响。随着洗脱体积的增大回收率增高,但产品浓度降低。为了得到较高的回收率可以增大洗脱体积。
△ 洗脱时间过短
    洗脱时间对回收率也会有一定影响。洗脱时放置一分钟可达到较好的效果。
质粒质量不高:
△ 混有蛋白
    不要使用过多菌体。溶液1、2、3处理并离心后溶液应为澄清的,如果还混有微小蛋白悬浮物,可再次离心去除后再进行下一步骤。
△ 混有RNA
    RNase A处理不彻底,请减少菌体用量或加入溶液3之后室温放置一段时间。如果溶液1已保存6个月以上,请在溶液1中添加RNase A。
△ 混有基因组DNA
   加入溶液2和3后应温和混匀,如果剧烈振荡,可能把基因组DNA剪切成碎片从而混杂在质粒中。如果加入溶液2后过于粘稠,无法温和混匀,请减少菌体用量。细菌培养时间过长会导致细胞和DNA的降解,不要超过16小时。
△溶液3加入时间过长
    溶液3加入后,放置时间不要太长,否则有可能会产生小片段DNA污染。
△ 含大量核酸酶的宿主菌
    宿主菌含大量核酸酶,在质粒提取过程中降解质粒DNA,影响提取质粒DNA的完整性,最好选用不含核酸酶的大肠杆菌宿主菌,如DH5α和Top10。
△ 裂解时间过长
    加入溶液2后裂解时间不应超过5分钟。
△ 质粒的二聚体和多聚体形式
质粒复制过程中形成的,与宿主菌相关,电泳可检测出。