庄盟生物

当前位置:首页 - 技术服务 - 产品常见问题

RNA提取的原理与方法

发布者:庄盟生物发布时间:2015-04-09浏览次数:3876次

细胞中的RNA可以分为信使RNA、转运RNA和核糖体RNA三大类,不同组织总RNA提取的实质就是将细胞裂解,释放出RNA,并通过不同方式去除蛋白,DNA等杂质,最终获得高纯度RNA产物的过程。

RNA提取流程

1.样品处理

从各种不同来源样品(如细菌、酵母、血液、动物组织、植物组织和培养细胞),或同一来源样品的不同组织(如植物幼嫩叶片、成熟根、茎等)中提取高质量的RNA,因细胞结构及所含的成分不同,样品预处理的方式也各有差异。

样品的要求

最好使用新鲜的样品或取样后立即在低温(-20℃或-70℃)冷冻保存的样品,避免反复冻融,因为这会导致提取的RNA降解和提取量下降。

样品预处理方式

植物材料-液氮研磨

动物材料-匀浆、液氮研磨

细菌-溶菌酶破壁

酵母-液氮研磨、玻璃珠处理、混合酶破壁

2.细胞裂解

异硫氰酸胍/苯酚法(TRIZOL)

这是一种传统的RNA提取方法,适用于大部分动植物材料,但对于次生代谢产物较多的植物材料提取RNA效果较差。异硫氰酸胍能使核蛋白复合体解离,并将RNA释放到溶液中,采用酸性酚-氯仿混合液抽提,低PH值的酚将使RNA进入水相,而蛋白质和DNA仍留在有机相,从而可以完成RNA的提取工作。

该法应用非常广泛,适用于包括动物组织、微生物、培养细胞等在内的各类动物性材料,同时还适用于次生代谢物较少的植物性材料,如幼苗、幼叶等。该法主要应用在动物组织和培养细胞的RNA提取中。

胍盐/β-巯基乙醇法

适用于各种不同动物材料和次生代谢物少的植物材料。

在这种方法中,胍盐使细胞充分裂解,β-巯基乙醇作为蛋白的变性剂在实验全程中可以抑制RNaseA的活性,保护RNA不被降解。

我公司的“GREEN”系列总RNA 提取试剂盒是基于这种方法开发的产品,分别适用于各类不同的材料。此系列产品的具体实验步骤和适用范围在实验技术手册中有详细介绍,实验者可根据自己的需要进行选择。

其它方法

有些植物材料多糖多酚含量较高,如植物果实,番茄的叶子等,有些植物木质化程度较高,如根茎等组织。针对这类材料本公司推出了一种全新的植物总RNA提取试剂,该试剂特别适合于从富含多糖、多酚、淀粉的材料中提取纯度高、完整性好的总RNA,有关的具体步骤将在分论中详细介绍,实验者可根据自己的需要进行选择。

3. RNA纯化及获得

纯化要求

RNA样品中不应存在对酶(如逆转录酶)有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子。避免其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染。排除DNA分子的污染。

纯化方法及沉淀

方法一:有机溶剂抽提法

氯仿抽提

在使用RNA提取试剂进行RNA提取时,常使用氯仿进行抽提,以去除蔗糖、蛋白等杂质,并促进水相与有机相的分离,从而达到纯化RNA的方法。在本公司的提取RNA的产品中,与TRIzol同型试剂法及其衍生试剂盒。

沉淀

氯仿抽提RNA后,一般采用了异丙醇或乙醇来沉淀水相RNA。加入0.6倍水相体积的异丙醇或与水相等体积的异丙醇,室温沉淀20-30分钟,高速离心,可获得RNA沉淀。

洗涤沉淀

加入无RNase的75%乙醇,将RNA沉淀振荡悬浮,使RNA沉淀中的盐离子被充分溶解。然后再离心10-30分钟。再次沉淀RNA。离心后,小心倒掉上清(注意不要倒出RNA沉淀),随后快速离心1-2秒,将残留在管壁上的乙醇手机到管底后,用小枪头吸净,超静台中风干1-2分钟(注意不要晾得太干,否则RNA沉淀不易溶解)。

溶解沉淀

加入适量RNase-free ddH2O溶解RNA沉淀。

方法二:硅基质吸附法

随着实验方法的改进,现已发展出一种采用吸附材料纯化核酸的方法。目前较常见的有:硅基质吸附材料、阴离子交换树脂和磁珠等。硅基质吸附材料因其具有可特异吸附核酸,使用方便、快捷、不使用有毒溶剂如苯酚、氯仿等优点,成为核酸纯化的首选。

本公司生产的总RNA提取试剂盒(ZP403-ZP407)和GREENspin系列总RNA提取试剂盒即采用硅基质吸附达到RNA分离纯化目的,通过专一结合RNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系统,使样品在高盐条件下与硅胶膜特异结合,而蛋白、有机溶剂等杂质不能结合到膜上而被洗脱,盐类则被含有乙醇的漂洗液洗涤,最后用RNase-free ddH2O将RNA从硅胶膜上洗脱下来。

一些特殊组织的RNA提取

纤维组织

心脏/骨骼肌等纤维组织提取RNA的关键在于彻底破碎组织。这些组织细胞密度低,单位重量的组织中RNA含量较低,建议增加起始量。此外,一定要在液氮中将组织彻底磨碎。

蛋白/脂肪含量较高的组织

脑或植物脂肪含量高,酚/氯仿抽提后,上清含白色絮状物。必须用氯仿再次对上清进行抽提。

核酸/RNase含量高的组织

脾、胸腺等组织的核酸和RNase含量很高,在液氮中研磨,再快速匀浆,能有效灭活RNase。如加入裂解液后变得粘稠,酚/氯仿抽提不能有效分层,则加入更多裂解液可以解决此问题。多次酚/氯仿抽提可以去除更多残留的DNA。如果加入乙醇后马上有白色沉淀形成,表明可能有DNA污染,可以在核酸溶解后用酸性酚/氯仿再次抽提或者用Dnase1消化,去除DNA污染。

植物组织和真菌组织

植物组织和真菌组织比动物组织更为复杂,一般选择在液氮条件下对样品进行研磨,以避免内源RNase降解RNA。如果RNA降解问题不能解决,大多数情况下是样品中含有的杂质所致。许多植物和真菌中的内含杂质和多糖、多酚等都会残留,因为这些杂质分子与RNA有一些相似性,可与RNA同时沉淀或者吸附,因此在植物和真菌组织的提取中,需要用一些特别的步骤或者特别的试剂来去除多糖多酚等杂质的干扰和污染。

RNA评价与鉴定

提取得到RNA溶液后,我们需要对RNA进行相关的质量检测,以确定它是否符合后续实验的要求。RNA用于不同的后续实验,对其质量要求不尽相同。cDNA文库构建要求RNA完整且无酶等抑制物残留;Northern blot实验对RNA完整性要求较高,对酶反应抑制物残留要求较低;RT-PCR实验对RNA完整性要求不太高,但对酶反应抑制物残留要求严格。因此在进行不同的实验时应选择不同的方法纯化RNA,以达到最佳的实验效果。

RNA得率检测—分光光度计法

RNA得率有很强的组织特异性,不同组织RNA的丰度和RNA提取的易难程度共同决定了该种组织的RNA得率。一般来说,可通过分光光度计测定RNA溶液在260nm处的吸光值来计算RNA的含量。RNA溶液在260、320、230、280nm下的吸光度分别代表了核酸、溶液浑浊度、杂质浓度和蛋白等有机物的吸收值。用标准样品测得在波长260nm处,1ug/mlRNA钠吸光度0.025(光程为1cm),即OD260=1时,样品中RNA浓度为40ug/ml。通常分光光度计OD260的读数要介于0.15-1.0之间才是可靠的。因此RNA提取结束后,要根据大概产量稀释到适当浓度范围,再用分光光度计检测。按下面的共识计算总RNA浓度:

总RNA浓度(ug/ml)=OD260×稀释倍数×40ug/ml

RNA纯度检测---分光光度计法

通过OD260/280来检测RNA纯度,OD260/230作为参考值。

OD260/280在1.9-2.1之间,可以认为RNA的纯度较好;

OD260/280值小于1.8,则表明蛋白杂质较多;

OD260/280值大于2.2,则表明RNA已经降解;

OD260/230值小于2.0,则表明裂解液中有异硫氰酸胍和β-巯基乙醇法残留。

注意:如果用TE溶解或洗脱RNA,会使OD260/280值偏大。