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PCR反应各个组分和条件

发布者:庄盟生物发布时间:2015-04-09浏览次数:1405次

PCR反应组分

引 物

引物与模板配对的长度应至少为17个核苷酸,最高不宜超过30个核苷酸,最佳长度为20-24个核苷酸,如需插入酶切位点,应在酶切位点5'端多加几个碱基,有利于酶切。引物的(G+C)%含量组成应均匀,尽量避免含有相同的碱基多聚体;两个引物中(G+C)%含量应尽量相似;引物内部应避免形成明显的二级结构,如发夹结构;两个引物之间不应发生互补;特别是在引物3'端最好有富有GC,这样退火后有利于3'端的延伸。人工合成的引物需经过色谱层析或PAGE纯化,以除去未能合成至全长的短链等杂质。引物的终浓度一般为0.1-1μM左右,浓度太高会导致非特异性扩增,太低则扩增产物太少。

模 板

模板可以是单链DNA,也可以是双链DNA,质粒DNA的扩增效率略低于线状DNA。模板量一般不需太多,不超过1μg为宜,因为模板量过多可能导致非特异性扩增增加,但是要考虑模板中靶序列的含量。例如:使用基因组为模板扩增单拷贝或低拷贝靶序列,就需要适当加大模板用量。

反应缓冲液

缓冲液的PH值,盐离子浓度、助溶剂成分等都会对PCR反应产生影响。我公司提供的Taq酶通用缓冲液PH值为8.4。Mg2+浓度为1.5mM,可以适用于大多数PCR反应,但它并非对任何模板和引物的组合都是最佳的。

酶  量

50μl反应体系可用0.5-5U酶,酶量的选择与模板DNA的量、扩增片段大小等有关,酶量过多易发生非特异性反应,而且可能增加突变的机率,尤其在进行高保真扩增时,应尽量减少酶量,但酶量过少时反应性能会下降。


PCR反应条件

变性温度与时间

模板变性温度是决定PCR反应中双链DNA解链的温度,达不到变性温度就不会产生单链DNA模板,PCR也就不会启动。变性温度低则变性不完全,DNA双链会很快复性,因而减少产量。变性温度太高,又会影响酶的活性,一般情况下可设为94℃ 20-30秒,高温时间应尽量缩短,以保持耐热DNA聚合酶的活力,最高变性温度不宜超过95℃。

退火温度与实践

退火温度决定PCR特异性与产量。温度高特异性强,但过高则引物不能与模板牢固结合,DNA扩增效率下降;温度低产量高,但过低可造成引物与模板错配,非特异性产物增加。合适的退火温度一般在45-68℃之间。设置特定反应的最适退火温度,可根据引物的(G+C)%含量进行推测,一般实验中退火温度比扩增引物的熔解温度Tm低5℃,退火时间一般为30-60秒,足以使引物与模板之间结合,没有必要长时间退火。

延伸温度与时间

PCR反应的延伸温度一般选择在70-75℃之间,延伸时间根据所有聚合酶扩增速度和扩增片段大小设定。如同样扩增2kb片段,若使用Taq酶只需要1分钟,使用Pfu酶则应设定2分钟以上。延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现。时间太短则可能得不到扩增产物或得到一些短的非特异性片段。

循环次数

可根据模板DNA的量,扩增片段的大小和扩增产物的下步应用等因素,设定30-40个循环。循环次数太少,扩增量不足,如果循环次数太多,错配几率会增加,非特异性背景严重。所以,在保证产物得率的前提下,应尽量减少循环次数。